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Les tests du SARS-CoV-2 : un point d’actualité
25 - 05 - 2020
Auteur : Christophe Teillaud, Conseiller scientifique de l’Union Dentaire & Diplômé de l’Institut Pasteur de ParisAccédez au résumé de cet article en cliquant ici
Sommaire
Historique de la pandémieStructure du virus et multiplicationRéponse immunitaireLes tests de diagnostic de l’infection par le SARS-CoV-2- Les tests de détection directe du virus
- Description du test
- Résultats
- Prise en charge par l’assurance maladie
- Tests salivaires de détection directe du SARS-CoV-2
- Description et prise en charge des tests sérologiques
Historique de la pandémie
Le SARS-CoV-2* est un virus émergent apparu en Chine en décembre 2019. Ce nouveau coronavirus, probablement d’origine animal, est responsable d’une pneumonie aiguë sévère appelée Covid-19 (Coronavirus disease-2019). C’est un virus extrêmement contagieux : l’OMS a déclaré l’état de pandémie le 11 mars 2020. L’OMS estime à plus de 5 127 125 cas confirmés à travers le monde (185 pays), et plus de 333 398 morts à la date du 25 mai 2020. En France le nombre de cas confirmés est de 181 951 dont plus de 28 218 décès (hôpitaux et Ephad). [caption id="attachment_27145" align="aligncenter" width="816"]
Ces particules virales de SARS-CoV-2 ont été isolées à partir d’un patient(micrographie électronique à transmission). Source Inserm[/caption] Devant la gravité de cette pneumopathie hautement contagieuse, les autorités sanitaires de la grande majorité des pays touchés par l’épidémie ont opté pour un confinement des populations afin d’enrayer la diffusion du virus, seul moyen permettant d’éviter l’engorgement des systèmes de santé. La transmission du SARS-CoV-2 se fait essentiellement par la voie respiratoire après inhalation de virus en suspension dans les gouttelettes de salive ou dans les sécrétions nasales, projetées lors d’un éternuement ou d’une toux et également en parlant par l’émission de postillons (gouttelettes de Pflüge). Compte tenu de ce mode de transmission, la distance minimale à respecter entre deux personnes permettant d’éviter la transmission du virus est de 1 mètre. En France, le confinement, décrété par le Président de la République le 18 mars, a été prolongé jusqu’au 11 mai, date à laquelle il a pris fin. La sortie du confinement a fait l’objet de mesures et de modalités d’application bien définies, celles-ci dépendent essentiellement de la situation sanitaire de la France et de l’évolution de l’épidémie après cette date. Les tests de détection directe du virus et/ou les tests sérologiques (présence d’anticorps anti-SARS-CoV-2) dont certains ont été validés récemment par la HAS° (Haute Autorité de Santé) ne sont pas envisageables, d’après les autorités sanitaires, à l’échelle de toute la population française. Les tests de détection directe sont réservés aux patients suspectés d’être infectés par le SARS-CoV-2 ou qui ont été malades Covid-19, parmi ceux-ci figurent les personnels soignants fréquemment en contact direct avec les malades. La reprise progressive de notre activité professionnelle doit se faire dans des conditions de sécurité sanitaire optimales respectant les recommandations du Conseil National de l’Ordre des Chirurgiens-Dentistes (CNO) validées par la HAS°°. Le contact très rapproché avec nos patients lors des soins que nous leur prodiguons, représente un risque de transmission du SARS-CoV-2, celui-ci étant présent dans les sécrétions naso-pharyngées et salivaires. Certains soins dentaires entraînent la diffusion du SARS-CoV-2 dans l’environnement du cabinet principalement par nébulisation et par la création de micro-gouttelettes. Les conséquences potentielles d’une infection par le SARS-CoV-2 liée à nos gestes opératoires sur l’état de santé général de nos patients et sur celui des chirurgiens-dentistes et de leur personnel peuvent être très graves. La réalisation de tests de détection directe du virus et/ou de tests sérologiques pour les chirurgiens-dentistes ainsi que pour leur personnel et/ou (sous conditions) pour leurs patients est pertinente. Une synthèse des dernières données scientifiques et cliniques sur les tests de détection directe du SARS-CoV-2 et sur les tests sérologiques (recherche des anticorps anti-SARS-CoV-2) disponibles actuellement est présentée. *SARS-CoV-2 : Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 ou coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère.°Avis n° 2020.0033/AC/SEAP du 20 mai 2020 du collège de la Haute Autorité de santé relatif à l’inscription sur la liste des actes et prestations mentionnée à l’article L. 162-1-7 du code de la sécurité sociale, de la détection des anticorps sériques dirigés contre le coronavirus SARS-CoV-2.°°HAS : « Réponse rapide : Mesures et précautions essentielles lors des soins bucco-dentaires après le déconfinement » (19 mai 2020).
Structure du virus et multiplication
La connaissance de la structure du SARS-CoV-2 permet d’envisager différentes stratégies de traitements curatifs ou préventifs (vaccins), et permet la mise au point de tests de diagnostic direct ou indirect. Il s’agit d’un virus à ARN simple brin appartenant à la famille des Coronaviridae, qui est constitué de l’extérieur vers l’intérieur : D’une enveloppe constituée de phospholipides où sont ancrées des protéines, dont la protéine S (Spike c’est à dire en épine) responsable de l’attachement du virus avec la membrane cellulaire cible (cellule pulmonaire par exemple). La protéine S de grande taille est constituée de trois monomères dont l’un comporte la zone de contact avec le récepteur appelé ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine 2)* présent à la membrane de la cellule cible. Cette partie de la protéine S fait l’objet des recherches menées pour la mise au point d’un vaccin induisant la production d’anticorps neutralisants empêchant le contact entre le coronavirus et la cellule cible. En l’état actuel des connaissances, il semble que le SARS-CoV-2 soit faiblement immunogène, la réponse immunitaire humorale (production d’anticorps) étant de faible intensité. Les autres protéines E et M sont ancrées dans l’enveloppe. *Il s’agit d’une protéine exprimée à la surface des cellules épithéliales pulmonaires. Cette enzyme est l’une des composantes centrales du système rénine/angiotensine qui contrôle la pression artérielle.
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Les coronavirus sont au contact de cellules épithéliales, ces images ont été obtenues microscopie électronique à transmission in vitro. Source: Inserm[/caption]
Le génome viral et sa réplication
Il est composé d’un ARN linéaire simple brin extrêmement long associé à une protéine N formant la nucléocapside. La fusion de l’enveloppe du virus avec la membrane de la cellule hôte survient après le contact entre la protéine S et son récepteur ACE2 (figure 1). Une autre protéine enzymatique appelée TMPRSS2° intervient également dans cette phase de contact entre le virus et la cellule hôte. Une fois à l’intérieur de la cellule hôte, la phase de réplication (multiplication) de l’ARN viral peut commencer. L’ARN viral est traduit, il donne naissance à une enzyme, la polymérase qui va amplifier le génome viral et synthétiser les protéines du coronavirus utiles à son auto-assemblage par différents mécanismes moléculaires. La libération du virus à l’extérieur de la cellule hôte (par bourgeonnement) est suivie de la dissémination des particules virales hors de l’organisme. La contagiosité de l’individu à ce stade de la maladie est alors maximale (excrétion du SARS-CoV-2 par expectoration par exemple). °TMPRSS2 (Transmembrane serine protease 2) : il s’agit d’une enzyme qui participe à la fusion de la membrane du virus avec la membrane de la cellule hôte.
Réponse immunitaire
Les études actuelles de la réponse immunitaire induite par le SARS-CoV-2 permettent la mise au point de tests sérologiques fiables à des fins de diagnostic et de suivi de la maladie. Elles permettront également de mieux appréhender la maladie induite par le virus et d’en traiter les conséquences parfois dramatiques (explosion cytokinique non expliquée à ce jour et très difficilement maitrisable). A terme, la mise au point d’un vaccin est l’un des objectifs des équipes de recherche. Les résultats de ces nombreuses études montrent toute la complexité de la réponse immunitaire face au SARS-CoV-2, notamment celle qui conduit à la production d’anticorps spécifiques dirigés contre ce nouveau coronavirus. Comme dans toute infection virale ou bactérienne, le système immunitaire (en l’absence d’immuno-déficience comme par exemple dans le SIDA), va défendre l’organisme contre le SARS-CoV-2 par deux mécanismes :Une réponse immunitaire humorale adaptative
Elle correspond à la production d’immunoglobulines ou anticorps par les lymphocytes B (cellules du sang circulant) différenciés en plasmocytes (dans les ganglions lymphatiques). La réponse immunitaire humorale fait l’objet de nombreuses études sérologiques dans le cadre de l’infection par le SARS-CoV-2 pour comprendre notamment la cinétique de production des anticorps anti-SARS-CoV-2 (délais d’apparition) et/ou de déterminer leur spécificité et leur capacité de protection (neutralisation du virus).Il existe, chez l’homme, 9 classes et sous-classes d’immunoglobulines (ou isotypes) : IgM, IgD, IgG (4 sous-classes : IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgE et IgA (2 sous-classes : IgA1 et IgA2). Leurs fonctions sont différentes lors de la réponse immunitaire. Les IgM sont les premières immunoglobulines produites lors de la réponse primaire, leur spécificité est moindre que les IgG produites lors de la réponse secondaire (les IgG reconnaitront spécifiquement le SARS-CoV-2). Les IgE sont impliquées dans des mécanismes allergiques (anaphylaxie par exemple). Les IgA sont très abondantes dans les sécrétions séromuqueuses, par exemple la salive où leur rôle est de neutraliser les bactéries orales.
Fonctions des anticorps anti-SARS-CoV-2
Les anticorps produits lors de l’infection par le SARS-CoV-2, d’abord des IgM puis des IgG beaucoup plus spécifiques du coronavirus, vont normalement le repérer puis le neutraliser. La destruction du coronavirus est effectué par les monocytes et les macrophages par phagocytose. Après l’infection, des lymphocytes B à mémoire se formeront, ils seront réactivés en cas de nouveau contact avec le SARS-CoV-2. Dans le cas du SARS-CoV-2, le délai d’apparition des IgM est d’environ une semaine, les IgG, plus spécifiques du coronavirus, sont produites ensuite. Les IgM et les IgG sont détectables en moyenne deux semaines après l’apparition des symptômes, ce délai peut être toutefois rallongé chez certains patients asymptomatiques. L’incertitude demeure actuellement sur la durée de protection de ces anticorps, des recherches doivent être menées à long terme sur cette question. Compte tenu de ces délais, l’OMS ne recommande pas la réalisation des tests sérologiques àdes fins de diagnostic précoce (HAS, OMS le 08 avril 2020).Une réponse immunitaire cellulaire
Les études actuellement menées sur l’immunité cellulaire dans l’infection par le SARS-CoV-2 sont peu nombreuses, les données scientifiques sont trop peu pertinentes pour définir le rôle de cette immunité dans la destruction du virus et/ou des cellules infectées par le SARS-CoV-2. Normalement, la réponse immunitaire cellulaire implique, entre autres cellules sanguines, les lymphocytes CD8 cytotoxiques. Les lymphocytes CD8 détruisent indirectement les cellules infectées par un virus par différents mécanismes immunitaires plus ou moins spécifiques (ADCC ou cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps). Il est probable qu’il en soit de même avec les cellules infectées par le SARS-CoV-2, seules des recherches menées sur le long terme pourront le montrer.Les tests de diagnostic de l’infection par le SARS-CoV-2
Il existe deux types de tests de diagnostic
Les personnes susceptibles d’être infectées par le SARS-CoV-2 ou les malades avérés Covid-19 font l’objet de tests de diagnostic qui permettent de confirmer ou d’infirmer la présence du coronavirus. Des tests sérologiques sont réalisés afin de déterminer le statut immunitaire des malades après leur guérison et d’assurer leur suivi. La détection directe du virus se fait à partir de prélèvements naso-pharyngés ou des voies respiratoires basses (cavité buccale). La réponse immunitaire humorale est évaluée par la détection d’anticorps anti-SARS-CoV-2 dans des prélèvements sériques après une infection suspectée ou avérée par le coronavirus*. *HAS : fiche pédagogique « COVID-19 : Prérequis sur les tests », 18 mai 2020Les tests de détection directe du virus
Ces tests moléculaires consistent à rechercher les virus dans des prélèvements biologiques respiratoires (naso-pharyngés) ou au niveau des voies respiratoires basses (crachats et salive) chez des patients présentant des symptômes de détresse respiratoire aiguë. Le prélèvement est réalisé par du personnel qualifié, doté d’équipements particuliers, à l’aide d’écouvillons atteignant des zones anatomiques difficiles d’accès. A ce jour, les seuls tests recommandés pour poser le diagnostic biologique du COVID-19 lors de la phase aiguë sont les tests moléculaires par RT-qPCR (Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction)*. Ils reposent sur la détection du génome viral, à partir d’un prélèvement biologique. Dès le début de l’épidémie en France, le Centre National de Référence (CNR) des virus des infections respiratoires (dont la grippe) de l’Institut Pasteur a mis au point ces tests. Le CNR a une triple mission :- La mise au point des tests et leur diffusion.
- Définir la sensibilité et la spécificité des tests.
- S’assurer de la performance des tests commerciaux.
Description du test
Le test appelé RT-qPCR, dont la spécificité est excellente, permet la détection rapide du SARS-CoV-2 par amplification de son génome. Ce test impose des conditions techniques rigoureuses de manipulation des échantillons prélevés afin d’éviter toute contamination qui fausserait les résultats. Il se déroule en deux phases : [caption id="attachment_27149" align="aligncenter" width="1030"]
La détection directe du SARS-CoV-2 est réalisée à l’aide de kits de RT-PCR (transcription inverse par réaction de polymérisation en chaîne). Il s’agit d’une technique de biologie moléculaire qui permet d’amplifier le génome viral (l’ARN) et de confirmer ou d’infirmer la présence du SARS-CoV-2 dans des prélèvements biologiques par exemple naso-pharyngés d’un malade suspecté d’être infecté par ce virus.[/caption]
1-Transcription inverse
La première étape consiste à extraire l’ARN viral à partir des prélèvements, puis à transformer cet ARN viral en ADN complémentaire (ADNc) simple brin à l’aide de l’enzyme transcriptase inverse (ou Reverse Transcriptase).2-Amplification du matériel génétique
Un second brin d’ADNc est synthétisé puis amplifié à l’aide d’une enzyme (la Taq polymérase) afin d’obtenir une quantité suffisante de matériel génétique pour révéler la présence ou non de virus. Des quantités très faibles du génome viral peuvent être mises en évidence dans des prélèvements humains naso-pharyngés ou salivaires. Une fois l’amplification réalisée, la détection du génome amplifié est réalisée à l’aide d’un marqueur fluorescent. Pour confirmer la présence du SARS-CoV-2 dans un prélèvement biologique, un deuxième test est pratiqué dans les mêmes conditions. En effet, des résultats faussement négatifs (la sensibilité du test est d’environ 70% seulement) seraient dus à la difficulté technique des prélèvements naso-pharyngés par écouvillonnage qui sont opérateurs-dépendant. La quantité de virus dans les sécrétions du naso-pharynx varie dans le temps et selon le stade de la maladie, ce qui peut induire une interprétation erronée de résultats négatifs.Résultats
Le délai pour obtenir le résultat est de trois à cinq heures. Le résultat de cet examen biologique est adressé au patient via son médecin prescripteur. La cellule d'intervention de Santé Publique France en région, l'Agence Régionale de Santé et le centre de crise de la Direction Générale de la Santé centralisent les résultats de l’ensemble du territoire national pour établir des statistiques et en tirer des conclusions épidémiologiques.Prise en charge par l’assurance maladie
Les tests de détection du génome viral du SARS-CoV-2 par RT-qPCR sont des actes de biologie médicale remboursables par l’assurance maladie*. Les kits de diagnostic doivent, conformément aux recommandations de la HAS, être marqués CE et avoir été évalués au plan de leur performance par le CNR des virus des infections respiratoires. Une liste des kits validés, pris en charge par l’assurance maladie est mise à jour régulièrement par le ministère des Solidarités et de la Santé. *Arrêté du 7 mars 2020 portant modification de la liste des actes et prestations mentionnée à l'article L. 162-1-7 du code de la sécurité sociale (inscription de la détection du génome du SARS-CoV-2 par RT-PCR).D’autres tests plus simples d’utilisation, mais dont la sensibilité reste à confirmer sont disponibles : - détection directe de l’antigène viral à l’aide de bandelettes, par immuno-chromatographie. - des auto-tests qui détectent directement le génome du coronavirus.Tests salivaires de détection directe du SARS-CoV-2
L’avantage d’un test salivaire est qu’il est non invasif et qu’il permettrait un dépistage rapide du SARS-CoV-2 sans équipement lourd. La salive est un vecteur reconnu du coronavirus. A ce stade de la pandémie, les tests salivaires sont en cours d’élaboration puis feront l’objet d’une validation par les autorités sanitaires. Le laboratoire Sys2Diag du CNRS associé à une société de biotechnologie SkillCell© conjointement avec le CHU de Montpellier conduit une étude clinique pour la mise au point de tests salivaires (EasyCov©) de détection de l’ARN viral du SARS-CoV-2. Cette étude est menée auprès de patients testés positifs au Covid-19 et auprès des personnels soignants du CHU de Montpellier. La startup montpelliéraine Vogo est impliquée dans le développement de l’automatisation du test et dans le développement d’une application mobile. En parallèle, lors de la mise au point de ce test, des tests de RT-PCR détectant l’ARN viral seront réalisés comme contrôle afin de valider le test. La spécificité et la sensibilité de ce test seront également affinées afin de répondre au mieux au cahier des charges de la HAS. Le prélèvement salivaire est placé dans un tube contenant des réactifs pendant 30 minutes à 65°C. La lecture du résultat (test colorimétrique) se fait à l’oeil nu par le personnel soignant. Une fois la mise au point réalisée, ce test sera produit en grande quantité à l’aide d’une chaîne de production, puis une une version grand public sera envisagée (auto-test). Les tests sérologiques : recherche des anticorps anti-SARS-CoV-2 Les tests sérologiques nécessitent un prélèvement sanguin dans lequel sont recherchés des anticorps anti-SARS-CoV-2 (IgM et IgG) produits par les plasmocytes d’un patient. Ces tests doivent être réalisés au minimum une semaine après l’apparition des symptômes de la maladie, car la réponse immunitaire de production d’anticorps spécifiques (les IgG) du SARS-CoV-2 est variable selon les individus, elle peut aller jusqu’à plusieurs semaines. Les résultats permettent de dire si un patient (symptomatique ou non) a déclenché ou non une réponse immunitaire contre le SARS-CoV-2. « Ces tests ne sont pas recommandés ni par l’OMS ni par la HAS dans le cadre du diagnostic précoce de l’infection, lors de la première semaine suivant l’apparition des premiers symptômes (avis de l’OMS du 08 avril 2020). » La HAS a précisé dans un cahier des charges* les strictes conditions d’homologation des tests sérologiques proposés par différentes équipes de recherche (Institut Pasteur, Inserm, start-up…). Après homologation, et déclaration auprès de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), ils sont utilisables en routine, permettant ainsi un criblage des populations à grande échelle à des fins épidémiologiques. Critères d’évaluation des tests sérologiques par la HAS :- Présence d’un marquage CE
- Vérification de la sensibilité** clinique du test de détection des anticorps anti-SARS-CoV-2 dans le sang des patients Covid-19 : celle-ci doit être de 90% à 95%.
- Vérification de la spécificité° clinique du test : test négatif chez les non-malades, et absence d’anticorps anti-SARS-CoV-2 dans le sang de donneurs non infectés : celle-ci doit être de 98 %.
Les objectifs des tests sérologiques sont multiples
- Affirmer l’immunisation des patients infectés par le SARS-CoV-2 ce qui permet de sécuriser le retour des patients guéris au travail et les contacts intra-familiaux.
- Tester l’efficacité des candidats vaccins en contrôlant la réponse immunitaire humorale par la production d’anticorps anti-coronavirus.
- Recueillir des données épidémiologiques comme le taux de mortalité, le nombre de patients infectés.
Il existe deux catégories de tests sérologiques
Les tests ELISA* automatisables sont réalisables uniquement en laboratoire de biologie médicale équipés, ils mesurent de façon quantitative et semi-quantitative la production d’anticorps anti-SARS-CoV-2. Ils sont réalisés à partir de prélèvements sanguins (ponction veineuse). Les résultats de ces examens de biologie médicale sont certifiés par le laboratoire et sont donc traçables. Les tests unitaires (immunochromatographie, uniquement qualitatifs) (avec marquage CE) sont réalisés par ponction capillaire (au bout du doigt) par différents intervenants.- Les tests de diagnostic rapide (TDR) utilisés en laboratoire de biologie médicale.
- Les tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) réalisés par un médecin/un pharmacien non biologiste ou un infirmier dont les résultats sont placés sous la seule responsabilité de celui qui les réalise.
- Les auto-tests sont directement réalisés par les patients (pas de compte-rendu), ils sont sous la seule responsabilité des patients.
Description et prise en charge des tests sérologiques
La HAS* conditionne la réalisation des tests sérologiques (ELISA ou TDR) à une prescription médicale indiquant éventuellement le résultat d’une RT-qPCR et la date d’apparition des symptômes dans les conditions suivantes : 7 jours après l’apparition des symptômes pour les patients graves hospitalisés. 14 jours après l’apparition des symptômes pour les patients symptomatiques sans signe de gravité. Les tests recherchent dans les sérums la présence d’anticorps (IgM et IgG) dirigés contre la protéine S (entière ou une partie de celle-ci : le Receptor Binding Domain) responsable de la liaison du coronavirus avec la cellule cible ou d’anticorps dirigés contre la protéine de la nucléo-capside (NCP) qui est une protéine interne au virus. La recherche des deux classes d’immunoglobuline (IgM et IgG) couvre ainsi la période d’apparition des anticorps spécifiques des antigènes viraux. La détection d’IgA est possible également. A ce stade du développement des tests, la recherche des différents isotypes d’IgG n’a pas d’intérêt. Un résultat positif du test sérologique identifie les personnes ayant été en contact avec le SARS-CoV-2 (séroconversion), mais n’indique pas si le patient testé est contagieux ou pas. La présence d’anticorps anti-SARS-CoV-2 n’accompagne pas la baisse de la charge virale, c’est pourquoi la validation des tests sérologiques par la HAS est très stricte. Il est à noter qu’un résultat positif du test sérologique peut être du à la présence dans le sérum du malade d’anticorps anti-SRAS-CoV produits lors d’une infection précédente par le coronavirus appelé SRAS-CoV. En effet, les anticorps anti-SRAS-CoV (qui persistent dans le sérum pendant environ 20 ans) et les anticorps anti-SARS-CoV-2 nouvellement produits en cas d’infection par le SARS-CoV-2, détectent des antigènes similaires exprimés par les deux types de coronavirus, on parle de réaction croisée. Cette situation entraîne une interprétation erronée du test sérologique due à un résultat faussement positif. Devant les innombrables demandes d’homologation et de validation des tests sérologiques à travers le monde, certains pays ont assoupli leurs règles administratives, c’est le cas aux Etats-Unis d’Amérique avec la U.S. FDA (United States Food and Drug Administration) qui se réserve le droit a posteriori de retirer du marché un test non performant. En France, la HAS a progressivement émis plusieurs avis sur les tests sérologiques :- Sur les modalités d’utilisation des tests sérologiques*
- Sur les tests sérologiques rapides (TDR, TROD, auto-tests)**
- Sur le remboursement des tests sérologiques***
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